即将包埋后组织切成纳米级切片,并附着在电镜载网—通常是铜网上的过程。一般包括“修块”“半薄切片定位”“超薄切片”三步。
1. 修块
一般手工修整包埋块。用特制夹持器夹住包埋块,放在解剖显微镜下,用刀片先削去表面包埋剂,露出组织后四周以和水平面成45°的角度削去包埋剂,将侧面修成锥形体,正面修成体形或方型。若多余树脂较多,可用砂纸去除。
也可以商业仪器(如Leica EM TRIM2、EM RAPID修块机)进行精确修块。
2. 半薄切片定位
用超薄切片机切厚度为1μm-2μm的切片,称半薄切片。
在洁净载玻片上滴水,将切下的半薄切片用镊子或睫毛笔转移水滴上,放在45℃加热板上干燥,使切片展平,甲苯胺蓝染色后用光学显微镜观察定位。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的:a定位——通过光学显微镜观察,确定所要观察的范围,然后保留要用电镜观察的部分,修去其余部分。b——便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。
半薄切片定位以后,还会对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形,顶面修成梯形或长方形(最好是梯形),每边的长度为0.2mm~0.3mm。
3. 超薄切片
用超薄切片机进行。基本包括以下几点:安装样品块,安装钻石刀,对刀,切片,捞片。其中比较重要的是对刀和捞片。
对刀:
将已有的样品面与刀锋对齐的过程。进行超薄切片之前,一般已进行半薄切片,样品面光滑明亮。在体式镜下观察样品面与刀锋之间的距离,利用背光灯照明,关闭其他照明灯。当样品面与刀锋距离较近时,可以看见样品面非常亮一条亮条,利用这个亮条判断样品与刀是否对齐。
首先,样品面上下两条边需要与钻石刀刀锋平行,这个通过体式镜观察即可判断,如不平行,需要调整样品夹旋转旋钮。第二,样品面左右需要与刀锋平行,这个可以通过判断亮条左右是否一样宽窄来判断,如不平行,需要调整刀锋旋转旋钮调节,第三,样品面上下需要与刀锋平行,这个可以通过上下移动样品面,观察亮条是否有宽窄变化来判断,如不平行,需要调节样品面旋转旋钮调节。
捞片:
一般有三种方法:使用捞片圈,盖片,捞片。捞片时,先将挑选好的切片用睫毛笔集中,将不需要的切片用拨离,盖片时在体式镜下观察,对准所需切片由上往下覆盖,捞片时用睫毛笔推着切片缓慢提起。捞片相对较平,但操作更复杂。有时水面上的切片看起来并非均匀银白色反光,而有暗色区域,说明切片有皱褶,需要展片。展片时,用滤纸蘸取少量二甲苯,在不接触水面的前提下沿水面上方移动,利用二甲苯蒸汽将切片展平,再进行捞片。用10-15%酒精溶液代替水做收集液,也可以使切片展平。
超薄切片
动物组织
1、灌注固定
尽可能活体灌注固定。腹腔注射巴比妥酸盐麻痹实验体(如巴比妥钠,20 - 30mg/kg),打开腹腔,由腹主动脉插入针管,在肝脏附近切开一处静脉,启动蠕动泵开始灌注。先灌注PBS冲洗血液(37℃,体积约1.5倍血液体积,200g大鼠约需10ml),可在PBS内加入抗凝血剂,然后灌注固定液(先37℃,再4℃),持续5~10分钟。另一种灌注方法通过左心室,需要打开胸腔,动物呼吸停止,针管由左心室插入升主动脉,剪开右心耳,随后步骤与前面一致。该方法在胸腔打开后呼吸会立即停止,要求尽快进行后续操作,向心脏插针管比向腹主动脉插针管要简单,特别是对很小的实验动物。灌注后取出组织,切成1mm见方小块,用相同固定液固定约30-60分钟。
2、活检或直接取样固定
血管不发达的组织,快速活体取材后立即投入固定液,同样,活检样品也要立即投入固定液,再尽快切成小块。方法如下:麻醉或断头急性处死,解剖出所需器官,用解剖剪刀剪取一小块组织,放在干净的纸板上,滴一滴冷却的固定液,用新的、无油污锋利的(双面)刀片将材料切成大约1mm宽,2~3mm长的小块,再切成1mm³小块。若有方向要求,如空腔器官、皮肤、角膜等,要注意方向性,保证需观察部位。最后用牙签将小块逐一放入盛有新鲜冷固定液的有盖青霉素小瓶,冷藏低温固定(4℃)过夜后尽快送中心实验室进行处理。
微生物组织
生长在培养瓶和培养板中的培养细胞取材时,悬浮细胞可直接离心,贴壁细胞应先倒出培养液,采用胰蛋白酶消化或用细胞刮刮下。而后带培养液进行低速离心(1000~1500 rpm)10 min左右。离心完毕倒出培养液,管底的细胞团不要打散,沿管壁缓慢倒入适量的(一般为材料体积的5~10倍)2.5 ~ 3%戊二醛固定液,固定约1h,可在4°C冰箱固定过夜。尽快送中心实验室进行后固定,也可自行用1%锇酸固定后送样。
植物组织
植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗,宜先切成薄片状,适当固定后再切成小方块。
如组织含较多空气,不易下沉浸入固定液,可用真空泵抽气使之下沉。
组织取样
生物与聚合物电镜服务 Biological Sample & Polymers
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