超薄切片技术—修块、半薄、超薄

超薄切片是指将包埋后组织切成纳米级切片，并附着在电镜载网—通常是铜网上的过程。该过程一般包括修块，半薄切片定位，超薄切片这三部工作。

1. 修块

一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45°的角度削去包埋剂，其侧面修成锥形体，其样品正面修成体形或方型，如需要定位，可对样品面打一个角。如果多余树脂较多，也可以用砂纸。修块也可以使用商业化的仪器，如Leica EM TRIM2，EM RAPID修块机，可进行精确修块。

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2. 半薄切片定位

利用超薄切片机切厚度为1μm-2μm的切片，称半薄切片。

在洁净的载玻片上滴一滴水，将切下的半薄切片用镊子或睫毛笔转移水滴上，将载玻片放在45°C加热板上干燥，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，利用光学显微镜观察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蜡切片更能观察到细微结构。

半薄切片进行光学显微镜观察的目的：a定位——通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。b——便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。

半薄切片定位以后，还会对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度为0.2mm~0.3mm。

3. 超薄切片

超薄切片需用超薄切片机进行。超薄切片基本包括以下几点：安装样品块，安装钻石刀，对刀，切片，捞片。其中比较重要的是对刀和捞片。 

对刀：对刀是指将刀与样品面对其的过程。如下图所示：一般来说，进行超薄切片之前，已经进行了半薄切片，样品面一般十分光滑，反光明亮。对刀实际上是将已有的样品面与刀锋对齐的过程。在体式镜下观察样品面与刀锋之间的距离，利用背光灯照明，关闭其他照明灯。当样品面与刀锋距离较近时，可以看见样品面非常亮一条亮条，利用这个亮条判断样品与刀是否对齐。

首先，样品面上下两条边需要与钻石刀刀锋平行，这个通过体式镜观察即可判断，如不平行，需要调整样品夹旋转旋钮。第二，样品面左右需要与刀锋平行，这个可以通过判断亮条左右是否一样宽窄来判断，如不平行，需要调整刀锋旋转旋钮调节，第三，样品面上下需要与刀锋平行，这个可以通过上下移动样品面，观察亮条是否有宽窄变化来判断，如不平行，需要调节样品面旋转旋钮调节。

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捞片：一般有三种方法，使用捞片圈，盖片，捞片。捞片时，先将挑选好的切片用睫毛笔集中到一起，将不需要的切片用睫毛笔拨离，盖片时在体式镜下观察，对准所需切片由上往下覆盖即可，但容易产生皱褶，捞片时，用睫毛笔推着切片，然后如图所示从一边缓慢提起切片即可，捞片相对比较平，但操作相对复杂。有时水面上的切片看起来并非均匀的银白色反光，而有一些暗色区域，说明切片有皱褶，需要展片，Epon812通常不需要展片，Spurr通常需要展片，展片时，用滤纸蘸取少量二甲苯，沿水面上方轻轻移动，注意滤纸不可接触水面，利用滤纸上产生的二甲苯蒸汽将切片展平，展片后再进行捞片，或者也可以用10-15%酒精溶液代替水做收集液，也可以使切片展平。